东北黑土nirS型反硝化细菌群落和网络结构对长期施用化肥的响应

【目的】探明长期施用氮磷钾化肥对东北黑土农田土壤nirS型反硝化细菌群落和网络结构的影响,为更加合理的肥料配施提供理论依据。【方法】基于农业农村部黑龙江耕地保育与农业环境科学观测实验站平台,选取不施肥(NoF)、氮肥(N)、磷肥(P)、钾肥(K)、氮钾肥(NK)、氮磷肥(NP)、磷钾肥(PK)、氮磷钾肥(NPK)8个施肥处理,借助荧光定量PCR、Illumina MiSeq高通量测序和分子生态网络技术,分析东北黑土nirS型反硝化细菌丰度、群落及网络结构,及影响反硝化细菌群落变异的主要环境因子。【结果】1)长期施用氮肥均在显著增加nirS基因拷贝数的同时,降低了nirS型反硝化细菌的群落多样性,而磷、钾肥对其影响并不显著。2)Proteobacteria是所有处理中的优势反硝化细菌门,相对丰度为16.96%~27.34%,且氮肥的施用促进了隶属于该菌门中Bradyrhizobium的生长。3)PCoA分析结果显示,8个施肥处理nirS型反硝化细菌群落主要分成施氮肥和不施氮肥两组,说明长期氮肥的施用显著改变了东北黑土反硝化细菌的群落结构。结合Mantel test的结果可知,土壤pH是影响nirS型反硝化细菌群落改变的主要因素。4)分别构建施氮肥和不施氮肥的反硝化细菌分子生态网络,发现施氮肥和不施氮肥网络结构存在很大差异,长期施用氮肥明显简化了nirS型反硝化细菌的网络结构,同时使其网络结构稳定性降低,易受外界环境扰动。【结论】尽管施用化学氮肥有利于土壤养分的增加,但其土壤nirS型反硝化细菌群落及网络结构发生了较大改变,而磷、钾肥的施用对反硝化细菌群落无显著影响。本试验结果为进一步研究东北黑土区农田土壤反硝化微生物对不同施肥管理的响应机制提供了重要科学依据。     

Dynamics of nitrogen translocation from mature leaves to new shoots and related gene expression during spring shoots development in tea plants (Camellia sinensis L.)

The contribution of N remobilization is crucial for new shoots growth and quality formation during spring tea shoots development. However, the translocation mechanism of N from source leaves to sink young shoots is not well understood. In the present study, ¹⁵N urea was applied to mature tea leaves one week before bud break to track N remobilization in a field experiment. The dynamic changes in plant ¹⁵N abundance, contents of amino acids, and the expression levels of genes related to N metabolism and translocation were followed during the 18‐d development of new spring shoots until three expanding young leaves. The results showed that during the growth of new shoots the amount of ¹⁵N in the shoots increased, whereas the N_dff (N derived from ¹⁵N‐urea) in mature leaves decreased, showing that the foliar‐applied N in mature leaves was readily exported to new shoots. This process was found to be accompanied by decline of chlorophylls. In the mature leaves, expression CsATG18a and CsSAG12 involved in autophagy was dramatically induced (> 4‐fold) at approximately nine days after the bud breaking. The genes involved in the transformation of amino acids, including primarily CsGDH2, CsGDH4, CsGLT3, CsGS1;3, and CsASN2 were upregulated by > 3‐fold after bud breaking. The expression levels of CsATG8A, CsATG9, CsSAG12, CsGS1;1, CsGDH1, and CsAAP6 correlated negatively with the N_dff in mature leaves, but positively with ¹⁵N amount and total N amount in new shoots, suggesting these genes played important roles in N export from mature leaves. In the new shoots, the expression of most genes showed two defined peaks, one on six days and one on 12 days after bud breaking. The expression of CsGS2, CsASN3, CsGLT1, and CsAAP4 positively correlated with the ¹⁵N amount and total N amount in new shoots. These genes might be involved in the transport and re‐assimilation of N from mature leaves. The overall results demonstrated that the translocation of ¹⁵N from mature leaves to new spring shoots was regulated by the genes involved in autophagy, protein degradation, amino acid transformation and transport.     

不同温度下TMV侵染枯斑三生烟的LncRNA差异表达

【目的】 筛选不同温度下烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）侵染后枯斑三生烟（Nicotiana tabacum var. Samsun NN）差异表达的长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）,研究lncRNA在枯斑三生烟抗性反应中的作用。【方法】 N基因的温度敏感性使枯斑三生烟在25℃时具备对TMV的抗性、在31℃抗性丧失,在这两个温度条件下对枯斑三生烟接种TMV和磷酸盐缓冲盐水（phosphate buffered saline,PBS）,48 h后提取系统叶总RNA,构建链特异性文库后进行深度测序。对测序结果进行过滤后利用HTSeq将有效数据与近缘品种TN90（N. tabacum var. TN90）基因组比对,筛选得到lncRNA后利用FPKM法估计lncRNA的表达水平。通过edgeR筛选差异表达lncRNA（differentially expressed lncRNA,DElncRNA）,并利用qRT-PCR技术对这一结果进行验证。通过共定位及共表达分析预测DElncRNA的靶基因,通过参考基因组注释、GO和KEGG富集分析研究靶基因的功能。【结果】 4个处理共12个样本经lncRNA-seq各测得约8 000万条clean reads,共获得4 737条已知lncRNA、40 169条新lncRNA。其中64个lncRNA在不同温度条件下TMV侵染后存在差异表达,qRT-PCR测定结果显示这些lncRNA的测序正确率在80%左右,表明本研究所得测序数据具备较高的可信度。对DElncRNA进行靶基因预测,发现一些基因同时被25℃下调和31℃上调的DElncRNA靶向。靶基因注释功能丰富,主要参与植物抗病、激素和代谢等生理过程。部分可能与激素通路相关的lncRNA,在25℃下TMV侵染时呈现下调趋势,而在31℃下TMV侵染则呈现上调趋势。GO富集分析显示靶基因主要参与构成膜、囊泡等组分,具备钙、钾离子通道抑制剂活性等分子功能,使相应离子得以转运引发随后的反应,同时也参与发病、抗原加工和呈现、细胞分裂素代谢等生理过程。KEGG分析发现靶基因显著富集在植物激素信号转导通路,25℃下调和31℃上调的DElncRNA靶基因同时富集在激素信号传导、ABC运输蛋白、苯丙烷类生物合成等通路。【结论】 不同温度（25℃和31℃）条件下TMV侵染枯斑三生烟后,长链非编码RNA差异表达,DElncRNA通过作用于激素信号传导、物质转运等过程参与寄主系统获得性抗性反应。研究结果可为揭示植物系统获得性抗性中lncRNA的调控功能以及新型抗病毒技术开发提供依据。     

利用WGCNA进行玉米花期基因共表达模块鉴定

权重基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)是系统生物学的一种研究方法,在挖掘生物学数据与特定性状之间的生物学关系方面具有十分重要的作用。本研究利用玉米(Zea mays L.)自交系B73的14份不同发育阶段的转录组数据,筛选掉低表达丰度的基因,最终得到了22,426个高表达的基因用于创建基因表达矩阵;利用不同组织作为性状,创建表型矩阵。然后利用R软件中的WGCNA包建立了共表达网络,共得到20个模块。本研究将与组织相关性高于0.65的模块定义为组织特异性模块,最终鉴定到14个组织特异性模块。利用在线网站Agrigo对组织特异性模块中的基因进行GO (gene ontology)富集分析,发现14个模块中均可以得到富集种类。开花作为玉米生育周期中的一个重要生理过程,不仅代表着植物从营养生长到生殖生长的转变,也关系到产量、株高和抗逆性等农艺性状。本研究发现8个组织特异性模块中的基因可以富集到与开花调控的代谢通路。此外,有17个已经报道过的开花时间调控基因存在于共表达模块中,并且主要分布在Blue模块和Darkmagenta模块,因此本研究重点关注了这2个模块内部的基因调控网络。本研究通过计算不同组织中的基因表达丰度,并联合权重基因共表达网络分析的方法,鉴定到了具有生物学意义的共表达基因模块,挖掘到了数个开花相关的模块,有助于揭示玉米开花调控的遗传机制。     

固相萃取离子色谱法快速测定烟草中钾、钠、钙、镁和氨的研究

采用带固相萃取净化功能的样品萃取瓶超声萃取烟草样品,样品萃取液用石墨化炭黑球固相萃取净化。然后以IonPacCS12A阳离子交换色谱柱(3 ′ 150 mm,5 μm)为固定相,30 mM甲基磺酸为流动相,淋洗液流速1.0 mL/min,K+、Na+、Mg2+、Ca2+、和NH4+ 5种阳离子在6.0 min内可达到完全分离。采用自主设计的样品萃取瓶,可不经样品转移就完成样品的萃取、净化和过滤。和常规方法相比,操作流程得到简化,效率大幅度提高,灵敏度和回收率高、精密度好。为基因编辑素材钾、钠、钙、镁和氨的快速测定提供了高通量分析方法。     

黑龙江省主栽水稻品种抗稻瘟病基因的分子检测与分析

了解品种本身的抗性基因型对于水稻品种合理布局具有重要意义。为了明确稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-b、Pik-m、Pi9、Pii、Pi-d3在黑龙江省水稻品种中的分布情况,选取34份主栽品种,利用这6个抗瘟基因的功能标记,对供试材料进行分子标记检测。结果表明,Pi9的分布频率最高,其次是Pi-ta和Pik-m,Pi-b和Pii抗性基因分布频率较低,Pi-d3的分布频率最低;供试的34份水稻材料中,被检测出最多含有5个抗性基因,而最少只含有1个抗性基因,含有2个抗性基因的品种所占比例最大,龙粳40和龙粳42不含有待检测基因。     

苹果细胞分裂素氧化酶基因MdCKX7.2的克隆及抗性鉴定

采用同源克隆和PCR技术从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆细胞分裂素氧化酶基因MdCKX7.2(基因序列号:MDP0000279125)。该基因含有1 542 bp的完整开放阅读框,编码513个氨基酸。利用Plant CARE数据库对MdCKX7.2启动子顺式作用元件进行预测分析,发现MdCKX7.2启动子序列中存在光、干旱、脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯等响应元件。基因表达分析发现,‘嘎拉’幼苗中MdCKX7.2的表达明显受干旱和ABA的诱导。通过农杆菌介导的遗传转化获得MdCKX7.2转基因拟南芥植株。抗性试验表明,异位表达MdCKX7.2基因明显提高了拟南芥对干旱胁迫的抗性。拟南芥种子萌发试验表明,在拟南芥中异位表达MdCKX7.2提高了植株对ABA的敏感性,种子萌发率和幼苗鲜质量明显下降,与种子萌发相关基因的表达量明显上调。以上试验结果表明,MdCKX7.2在植物非生物胁迫响应中发挥重要作用。     

围垦对滨海稻田土壤N2O还原潜力的影响

稻田湿地生态系统的N₂O还原消耗潜力对缓解大气温室气体效应具有重要意义，而滨海自然湿地围垦改造成稻田后耕层土壤的N₂O还原速率及其微生物机制却鲜有报道。选取崇明岛光滩湿地为对照（WK0），比较研究不同围垦年限（19、27、51、86 a）的围垦区稻田耕作层土壤N₂O还原速率演替规律及其微生物数量变异特征。结果表明，土壤总有机碳含量（TOC）随围垦年限增长而显著增加，而土壤pH值、SO₄^2-浓度和EC值则均随围垦年限增长而呈逐渐下降趋势。土壤N₂O还原速率随围垦年限增长而显著增加，其中围垦86 a稻田土壤达到25.5 μg N₂O·g^-1·d^-1，与光滩湿地相比增加了58.4%。定量PCR结果发现，功能基因nosZ Ⅰ和nosZ Ⅱ拷贝数也随着围垦年限增长而显著增加，其中围垦86 a的稻田土壤功能基因分别为1.72×10⁸ copies·g^-1和4.36×10⁸ copies· g^-1，比光滩湿地稻田高出一个数量级。相关性分析发现土壤N₂O还原速率与功能基因nosZ Ⅰ拷贝数呈显著正相关，而功能基因nosZ Ⅱ拷贝数随围垦年限的增加率远高于功能基因nosZ Ⅰ；N₂O还原速率、功能基因nosZ Ⅰ、nosZ Ⅱ拷贝数与3个土壤理化指标（pH、EC、SO₄^2-）均呈负相关。因此，围垦造田促进了滨海湿地土壤N₂O还原过程，而功能基因nosZ Ⅰ数量的大幅增加是N₂O还原速率增加的重要原因。